Фиброин шелка и его потенциал для использования в регенеративной стоматологии

Исследователи из Румынского Университета Медицины им. Карола Давила – во главе с доктором медицинских наук, главой департамента биохимии и стоматологического медицинского факультета, профессором Марией Греабу представили интересный обзор по возможности использования шелкового фиброина в регенеративной стоматологии. Перевод этого обзора мы частично публикуем на нашем сайте для вашего внимания.

Фиброин шелка - это органический полимер, выделенный из волокон кокона шелка. Недавно он был всесторонне изучен как субстрат для тканевых хрящей, костей, связок, нервов, роговицы, а также для доставки лекарств.  Данный обзор посвящен недавнему прогрессу в изучении фиброина шелка и его возможном использовании в регенерационной терапии, в основном в стоматологической сфере. Использование данных было проведено в соответствии со стандартной методикой Кокрановского систематического обзора в котором Были использованы следующие базы данных: PubMed, Google Scholar, Medline и Библиотека Google. Из 151 связанных статей, которые были критически оценены, только 57 статей были включены в обзор. Есть доказательства того, что шелковый фиброин является биосовместимым полимером, также было доказано, что он является цитосовместимым с большим разнообразием клеток. Оказалось что композитные матрериалы из шелкового фиброина с гидроксиапаптитом, биостеклом, золотом или керамикой можно использовать в различных областях. Регенеративная стоматология может извлечь пользу из фиброина шелка из-за возможного будущего использования в имплантационной терапии, при образовании минерализованных тканей или заживлении ран слизистой оболочки щек.

1. Шелковый фиброин
Шелк представляет собой самый прочный  природный полимерный материал (1). Шелка от шелковичных червей и пауков обладают впечатляющими механическими свойствами и устойчивостью к окружающей среде, биосовместимостью, контролируемой протеолитической биоразлагаемостью, морфологической гибкостью и способностью модификации заряда боковой аминокислоты в иммобилизацию факторов роста (2). Фиброин шелка - структурный белок, выделенный из коконов волокна шелка тутового шелкопряда Bobymex mori (2, 3) и имеет долгую историю применения в клинических аппликациях в виде швов (2). Недавно он также был изучен в качестве субстрата для ткани хрящей, костей (4), (5), (6), связок, а также для доставки лекарств к органам (7), (8-10).

1.1.Шелковый фиброин в средствах доставки лекарств
Был исследован широкий спектр полимерных материалов для использования в качестве средства доставки лекарств, в том числе через биоразлагаемые синтетические полимеры, такие как биоразлагаемые полиэфиры полилактидглиголида (PLGA) и натуральные полимеры как коллаген (3). Добавление шелка, как оказалось, улучшило свойства контролируемого высвобождения препаратов. Было выяснено, что чем больше кристаллическое содержание шелка, тем медленнее происходит высвобождение капсулированного белка (7). Другие способы точной настройки выпуска лекарства из шелковой матрицы включают в себя введение загруженных лекарством микро - или наночастиц или нанесение микро- или наночастиц на шелковые фиброиновые пленки (11). Также шелковое покрытие липосом загруженное противоопухолевым препаратом Эмодин значительно замедляет высвобождение препарата без влияния на эффективность препарата (9). Кроме того, шелковые микросферы могут быть использованы также, как носители для доставки лекарств, учитывая тот факт, что шелковые микросферы намного меньше, чем PLGA микросферы (3).

1.2 Шелковые фиброиновые каркасы

Подражание естественному внеклеточному матриксу является одним из критических и сложных технологических барьеров, где разработка каркасов стала основным направлением исследований в области тканевой инженерии (12). Шелковый фиброин может выступать в качестве каркасного материала, субстрата на котором клетки могут процветать и получать стимуляцию факторов роста, которые определяют дифференциацию клеточных процессов (7), через контролируемую доставку препарата. Модуль сжатия  вспененных фиброиновых каркасов был лучше по сравнению с каркасами из коллагена, хитозана, PLGA и PLLA - материалов, которые интенсивно исследуются как материалы клеточных каркасов (13). Разнообразные клетки культивированные на фиброиновых каркасах сохраняли свою жизнеспособность. Эндотелиальные клетки которые были культивированы на шелковом фиброине пролиферировали, формируя после одной недели микрососудоподобные структуры (14). Также шелковая фиброиновая пленка и БМП-2 индуцировала остеогенную дифференцировка человеческой кости и стромальных клеток костного мозга (5). Кроме того, амниотическая жидкость стволовых клеток также была посеяна на биоинженерные шелковые конструкции где она смогла измениться в клетки остеобластов in vivo (15). In vitro культура в Хондро- или остеоиндуктивной среде показала, что шелковые конструкции, предварительно засеянные человеческими стромальными клетками костного мозга образовали участки новообразованной ткани, содержащие хондроцитоподобные клетки, в то время как на конструкциях из шелка предварительно засеяные с стромальными клетками костного мозга человека образовывали структуры похожие на узелки (16). Есть предположение, что нановолокна шелкового фиброина цитосовместимы с кератиноцитами и фибробластами человека (4, 6). Три формы шелковых фиброиновых матриц, тканные (микрофибра), нетканные (нановолокно) и пленка, были использованы для проверки совместимости с клеточными культурами нормальных человеческих ротовых кератиноцитов путем изучения прикрепления клеток и распространения клеток (17-19). Результаты показали, что фиброиновая нановолоконная матрица может быть предпочтительнее фиброиновой пленки шелка и матрицы из микроволокна шелка фиброина для биомедицинских нужд, таких как перевязочные материалы и каркасы для тканевой инженерии (17), (18). Кроме того, композитные шелковые каркасы, такие как наноструктурированный биокомпонент фиброина шелка / хитиновые каркасы оказались цитосовместимыми во взаимодействии с эпидермальными кератиноцитами человека (20). Остеобласты культивированные на фиброине шелка / наногидроксиапатитовых каркасах in vitro продемонстрировали отличную цитосовместимость, а также улучшенную жизнеспособность остеобластов (21). Помимо гидроксиапатита,  в фиброин шелка был включен коллаген, следовательно, были изготовлены заменители коллагена шелкового фиброина / гидроксиапатита (22). Этот би-шаблон материала показал хорошую биосовместимость и стимулировал мезенхимальный ствол клеток костного мозга выстроиться в клеточную линию остеобластов (22).

1.3. Биосовместимость фиброина шелка
Будучи белковой по природе, биодеградация фиброина шелка преимущественно происходит через протеолитические ферменты с нетоксичными продуктами разложения и беспроблемной деградацией in vivo. Шелковые каркасы имеют низкую иммуногенность, когда разделены иммуногенные и гликозилированные белки (23). Использование шелковых фиброиновых пленок при заживлении ран привело к значительному снижению распространения воспалительных нейтрофилов, чем в контрольной группе с животными (24), в то время как имплантация шелкового фиброинового каркаса подкожно у мышей привело к легкой воспалительной реакции, которая полностью исчезла через 12 недель (25). Признаки какой-либо воспалительной реакции при использовалании нановолоконной фиброиновой мембраны из шелка в течение 12 недель у кроликов для исправления дефектов черепа отсутствовали (26).

2.1 Применение фиброина шелка
Благодаря простоте обработки, отличной биосовместимости, замечательным механическим свойствам и приспосабливаемой разлагаемости - шелковый фиброин был исследован при изготовлении различных изделий, таких как пленки, пористые матрицы, гидрогели, нетканые маты , а также был исследован при использовании в различных тканях тела, в том числе костях, сухожилиях, связках, хрящах, коже, печени, трахеи, нервах (27), роговице (28), барабанной перепонке, зубах и мочевом пузыре (12). Поскольку фиброин шелка может быть желатинизирован и при этом сохраняет свою биосовместимость и проницаемость, он может быть использованы в различных композициях (29). Шелковый каркас использовался в процессах заживления ран (2), (30). Шелковый фиброиновый гель, содержащий электрически поляризованный гидроксиапатит является эффективным средством заживления ран позволяющим созревать фибробластам свинных клеток (29). Кроме того, что дополнение гидроксиапатита или поляризованного гидроксиапатита для фиброиновых каркасов из шелка улучшали свойства заживления раны, они усиливали миграцию эндотелиальных клеток, и поэтому количество мигрировавших клетки было в 1,5 раза выше, чем на пленке (30).

До сих пор основное внимание к препаратам на осснове шелкового фиброина уделялось системам доставки лекарств и регенерации тканей (11). Различные технологии точной настройки высвобождения из шелковых матриц фиброина включают встраивание загруженных лекарством микро- или наночастиц или покрытие микро- или наночастиц шелковых фиброиновых пленок (11). Например, гормон роста загруженный на шелковые фиброиновые каркасы был использован для реконструкции тканей кости и хрящей, а также для устройства регенерации сосудов и нервов равно как и средства для заживления ран. Кроме того, шелковые матрицы были предложены для пероральной трансмукозальной и глазной доставка лекарств (11). Шелковый фиброин также может быть использован в  методах регенерации нервной системы и может быть полезным в восстановление двигательной функции равно и для предотвращения болезненных ощущений после повреждений нерва (27). Имплантированое волокно с использованием электроопряденного шелка в 10-миллиметровом дефекте седалищного нерва у крыс при иммуноокрашивающем анализе нервной системы показал образование внутри нитей шелкового фиброина хорошо миелинизированых нервных волокон, с окрашенными нейронами аксонами а также  миелиновый белок (27).  Каркас из фиброина шелка были использованы для связи клеток в реконструкции тканей (31),(32). Мезенхимальные стволовые клетки высевали на гибридный каркас, состоящий из трикотажного фиброина шелка и выровненного фиброиновыми электропроводящими волокнами, что привело к образованию и производству связок белков (32).

2.2 Шелковый фиброин для регенерации костей
Шелковый фиброиновый каркас может быть хорошей заменой для регенерации кости с лучшими результатами, по сравнению с  коммерчески доступным каркасом из полимолочных кислот (33). Исследование in vitro показало, что фиброин шелка приводит к большему увеличению активности роста, чем полимолочная кислота.  Испытания in vivo показали, что фиброин шелка помог регенерировать 78,30% от первоначального объема кости, в то время как имплантация полимолочной кислоты привела только 49,31% костеобразования у крыс (33). Также гидрогели на основе шелкового фиброина, введенные в дефекты критического размера у кроликов привели к большему объему трабекулярности и толщине кости, значительно выше минерализация и скорость формирования кости по сравнению с PLGA - сополимером полимолочной-полигликолевой кислоты (34). Не только каркасы, но и шелковые фиброиновые мембраны доказали способность к регенерации костей у животных в проведенных исследованиях (35). Фиброиновые нановолоконные мембраны были вживлены в дефекты черепа кроликов для начала регенерации кости и привели к полному заживлению новой костью через 12 недель (26). После одного месяц имплантации шелкового фиброина подкожнов мягкие ткани у мышей увеличение было стабильным, а гистологический анализ выявил реваскуляризацию области через биоматериал (25). В другом исследовании на кроликах, был использован низкомолекулярный фиброин шелка с фибрином, богатым тромбоцитами, при этом новообразования кости составили 59,83 ± 10,92%  по сравнению с 49,86 ± 7,49% в контрольной группе, в то время как в тканях была немного увеличена минерализированная плотность (36).

Также небольшие фрагменты фиброина шелка способны увеличить экспрессию остеобластогенных генов и результаты микротетов ДНК показали, что значительно увеличилась щелочная фосфатаза коллагена типа I альфа-1, фибронектин, и трансформирующее проявление фактора роста-бета1 (37). Шелковые губки фиброина были использованы для поддержки ортопедической регенерации с использованием загруженных фиброиновых гелей с факторами роста и жировыми отложениями человека через мезенхимальные стволовые клетки (38). Эта конструкция имела ангиоиндуктивные, а также остеоиндуктивные способности, выраженное осаждением белка костного матрикса , активностью щелочной фосфатазы и отложением кальция, наряду с образованием сосудистой сети, о чем свидетельствует поверхность маркеров эндотелиальных клеток  (38). Шелковые каркасы из фиброина на водной основе с плазменным облучением были успешно испытаны на 48 бедрах при критических размерах дефектов и привели к образованию новых костей вокруг каркаса (39). Использование плазмы помогло изменить гидрофобную природу в гидрофильную (39). Кроме того, иммуногистохимическое исследование выявило увеличенную картину экспрессии в наборе  специфических генов остеобластов (TGF-β, TGF-β рецептор типа III, Runx2, коллаген типа I и остеокальцина) (39).

Шелковые фиброиновые каркасы разных размеров и отобранные остеогенные клетки использовались в разных экспериментах по изучению дифференциации мезенхимальных стволовых клеток человека вдоль остеобластной линии(40), (41). Шелковые нити из фиброина отобранные с помощью стволовых клеток человека показали хорошие результаты, приводящие к регенерации кости в исследованиях на животных (42). Было проведено исследование дефектов костей черепа у крыс, использование шелковых фиброиновых каркасов, засеянных человеческими стволовыми клетками из пульпы зуба и амниотической жидкостью стволовых клеток. После 4 недели имплантации и костной коррекции с большим количеством кости, наблюдались амниотические стволовые клетки человека (42). Также шелковая нить, засеянная мезенхимальными стволовыми клетками человека, предварительно разделенными в остеогенной среде, как оказалось, способствует формированию кости в дефектах черепа у мышей (43). Кроме того, шелковые каркасы с мезенхимальными стволовыми клетками человека, которые ранее были дифференцированы по линии остеобластов in vitro были имплантированы в дефекты бедренной кости крыс, что привело к остеоиндуктивному эффекту. Дефекты были полностью устранены с помощью каллуса на внешних и около 30% вновь сформированных тканей костней внутри дефекта (1). Согласно исследованию, в котором  использовали человеческий костный мозг производящий мезенхимальные стволовые клетки, минерализация на шелковых фиброиновых каркасах с порами 112-224 мкм диаметр была наиболее эффективна в начальнымом периоде до культивирования клеток 9 дней (41).

По биомиметическим данным, пористое покрытие с биоматериалом на основе шелковых фиброиновых каркасов обеспечивает улучшенные результаты связи остеогенной среды с костими (44). Используя стромальные клетки костного мозга, посеянные на фиброиновые каркасы, удалось полностью восстановить костные дефекты нижней челюсти модели (44). Тем не менее, когда использовались шелковая фиброиновая нить или шелковый фиброин некоторые дефекты остались в центре конструкции с фиброиновой волокнистой соединительной тканью (44) показанное усилением регенеративного эффекта при добавлении стромальных клеток костного мозга. Однако шелк не является остеогенным материалом и имеет жесткость на сжатие значительно ниже, чем у родной кости (45). Гидроксиапатит (ГА) - шелковых фиброиновых каркасов был разработан для того, чтобы вызывать и поддерживать формирование минерализованного костного матрикса мезенхимальными стволовыми клетками человека, формирующие ткани кости путем двух механизмов: через остеокондуктивность материала, приводящего к увеличению производства костного матрикса , и путем предоставления мест нуклеации для нового минерала, в результате чего образуется трабекуляроподобная архитектура (45).

Однако в другом исследовании один только наногидроксиапатит привел к значительному более высокой регенерации кости, чем прививка с сочетанием шелка-фиброина и наногидроксиапатита (46). В Новой Зеландии дефекты стопы белых кроликов, обработанных наногидроксиапатитом, показали 40,16% ± 8,27% нового образования костной массы по сравнению с 16,62% ± 3,05% в гидроксиапатитовом трансплантате с шелковым фиброиновым каркасом (46). Кроме того, в том же исследовании, даже контроль привел к лучшим результатам (25,66% ± 10,98%) чем группа с фиброином шелка (46). Другие авторы поддержал идею, что гидроксиапатит / шелковая нить из фиброина могла бы быть использована для улучшения результатов, чем один только гидроксиапатитовый каркас (47). Композитный гидроксиапатит / регенерированный фиброин и повышенная активность щелочной фосфатазы клеток жизнеспособность, чем один каркас из гидроксиапатита (47). Также композитные шелковые каркасы с кристаллами наногидроксиапатита показали хорошие результаты при регенерации кости (21).

Композитные биостекло / шелк фиброиновые каркасы могут использоваться в будущем в лечении остеопороза и переломов, используя способность поддерживать регенерацию в результате длительного высвобождения PDGF-b и BMP 7, инкорпорированных в этот композитный каркас (48). Была также показана способность этих каркасов к ухудшению со временем при начале обмен костной ткани / ремоделирования (48). Кроме того, были иизготовлены нанокомпозиты из нановолокон шелка и золотых наночастицы в результате чего, эти каркасы привели к увеличению числа мезенхимальных стволовых клеток человека, культивируемых на них (49). Композиционные шелк-кремнеземные биоматериалы для костной регенерация были также изготовлены, а добавление кремнезема активирует остеогенные маркеры костного сиалопротеина и коллагена типа 1 у человеческих мезенхимальных стволовых клеток, подвергнутых остеогенным разделениям (50). Мезенхимальные стволовые клетки человека также прикрепляются, пролиферируют и дифференцируются к остеогенным линиям на композитном шелке / кремнеземной пленке (50).

2.3 Шелковый фиброин в стоматологии

Шелк-гель материал является перспективным биоматериалом для пародонтологии и челюстно-лицевой терапии, как в качестве основы для клеток так и отдельно в качестве биоматериала (25). В регенеративной стоматологии на основе терапии стволовых клеток часто требуется поддержка для доставки клеток и / или факторов роста к поврежденному участку (51). Шелковый фиброин является перспективным биоматериалом для тканевой инженерии, поскольку он не токсична и способствует клеточному росту (51). Основанный на успешном использовании шелковых каркасов в инженерии костной ткани, исследователи выявили их полезность для восстановления зубов и обнаружили, что клетки  зубного зачатка крыс посеяные на шелковые каркасы, предназначенные для минерализации тканей образовывали остеодентин (52). Зубные стволовые клетки человека, полученные из перидонтальной связки культивировали на фиброиновых пленках и показали дискретное распространение, а также управление уровнем выражения маркеров мезенхимального ствола - CD73, CD90 или CD105 (51). Кроме того комбинация человеческих зубных стволовых клеток на фиброин и графен оксид-биоинженерную конструкцию имеет сильный потенциал для будущего терапевтического использования в восстановительной стоматологии (51).

Новая иерархическая текстильная структура из Фиброин шелка была разработана для регенерация связок (31). Для этого человческие фибробласты пародонтальной связки культивировали в прямом контакте со структурой шелка, после чего была выявлена повышенная секреция аггрекана и фибронектина на 3 и 7 сутки культивирования без изменений секреции IL-6 и TNF-α (31). Хотя исследование пыталось регенерировать переднюю крестообразную связку, положительные результаты показывают перспективность использования этого метода в регенеративной стоматологии.   Шелковый фиброин может быть использован в имплантационной терапии в этом качестве. 

Полный текст обзора вы сможете прочесть в первоисточнике - http://www.stomaeduj.com/wp-content/uploads/2019/06/Silk-fibroin-and-potential-uses-in-regenerative-dentistry-a-systematic-review1.pdf